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将ADSCs接种于3D打印与FD制备而成的支架上观察情况

更新时间: 2019-10-09 14:11:38  查看次数: 18    
       组织工程发展日趋成熟,近年来涌现出大量对支架、目的细胞、信号因子的研究文章,但较少有对不同制备方法制成的支架与细胞复合物在体内降解性及成脂情况的研究,本实验将ADSCs接种于3D打印与FD制备而成的支架上,通过体外培养后,植入大鼠体内,观察支架大体降解及成脂情况。
       两组细胞-支架复合物在植入大鼠体内后2w、4w、6w观察见植入处伤口恢复完好,切开后无积液、积脓,支架随时间变化逐渐变小,绘制降解曲线图,发现3D组降解快于FD组,对两组支架各时间点大小变化行统计学分析,发现无统计学差异。分析影响支架降解的因素:一是与材料自身的性质相关,本实验选取的丝素蛋白、胶原蛋白均具有良好的降解性能;二是与支架上血管形成有关,支架孔隙率越高、连通性越好,越容易血管长入,进而加速了支架降解;三是支架所处的微环境,体内的多种活性物质,各种酶的消化作用,如胶原蛋白体内降解主要是基质金属蛋白酶的作用;四是发生免疫反应和保护性反应,产生巨噬细胞的吞噬作用;五是材料的形状及空间结构,疏松结构更易被分解,因各种化学物质更易渗入;六是制备的条件:包括3D打印机先进程度,两种原料配比的浓度,混合的比例等。因而3D支架降解较快。
       炎症反应的发生主要是外伤性刺激及复合物的异物刺激,虽然两种材料及微量的ADSCs免疫原性低,排斥反应发生少,但仍会有炎症的发生。其基本病理变化包括变质、渗出和增生。细胞、蛋白经趋化因子作用穿过内皮细胞从血管渗出,细胞趋化、游走至创伤及异物部位,中性粒细胞作为主要炎性细胞,在炎症早期24~48小时出现,主要产生炎性物质和吞噬作用,48~96小时后巨噬细胞出现,协调各类生长因子,并吞噬消化异物,淋巴细胞5~7天达高峰,可能参与胶原酶及ECM的重塑,而成纤维细胞2~3天出现,5天至3周大量分泌胶原,增生明显,后期炎细胞消失,纤维性修复,这与实验组织学结果基本一致。
       通过对各时间点标本行HE染色及Masson染色,镜下见3D组复合物以淋巴细胞浸润为主,伴少量中性粒细胞,残存支架结构较少,个别切片见支架完全降解,纤维膜下大量脂肪细胞填充,考虑为个体差异可能。FD组复合物早期以中性粒细胞多见,伴少量淋巴细胞和多核巨细胞,后期中性粒细胞减少,淋巴细胞增多,可见明显支架成分,支架间隙多量碎裂中性粒细胞。两组复合物外周均有纤维组织增生,其内见脂肪细胞,但3D组纤维随时间变化逐渐变细,量较少,而FD组纤维增生明显,可见粗大的蓝染纤维。行免疫组织化学染色,通过抗体与脂肪细胞的S100相关抗原反应,见脂肪细胞胞膜特异性染色阳性,呈棕黑色;因此可以得出,3D组较FD组复合物体内炎症反应轻,纤维增生程度轻,两组复合物均在在动物体内形成了脂肪。
       ADSCs成脂方法有化学试剂诱导(如地塞米松)、生物诱导(与目的分化细胞培养、支架种植),本实验采用后者的方法,将细胞接种于支架后植入体内,一段时间后取出,染色观察成脂情况。影响其成脂的因素有很多,如种属、个体、性别、年龄差异,取脂部位、取材方法、提取方法、培养基配方、细胞代数的不同,保存时间的长短,各类生长因子及激素的作用等。因此,本实验的成脂情况也有可能受到这些因素及某些不可控因素的影响。检验ADSCs成脂分化的方法有多种,如油红O染色,相关基因、蛋白的表达,电极诱导测量电阻等,其中油红O是最简便的。本实验采用免疫组织化学法,使S100抗体与脂肪细胞膜上的S100相关抗原产生免疫反应,从而对脂肪细胞进行标记染色,了解成脂情况。
       但是,其体内定向成脂分化的具体机制还不十分确切,如何综合利用上述因素,逐渐将体外实验或动物实验研究转化为临床研究,进一步实现真正的应用,仍是组织工程医学领域研究的难点。研究发现,3D打印的支架材料孔径适宜,孔隙率、吸水溶胀率、空间结构良好,利于细胞粘附、增殖,与细胞生物相容性良好。3D打印支架体内可降解,且降解性能良好。3D打印支架体内炎症反应及纤维化程度轻,在体内可形成脂肪组织,适宜于脂肪组织工程的研究。